植物轉(zhuǎn)錄因子研究

      轉(zhuǎn)錄因子（TF）是一類具有特殊結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，也稱為反式作用因子。通過(guò)與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件特異性結(jié)合，行使調(diào)控基因表達(dá)的功能。典型的轉(zhuǎn)錄因子一般具有4個(gè)功能結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合區(qū)（DNA-binding domain，DBD）、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)（transcription regulation domain，TRD）、寡聚化位點(diǎn)區(qū)（oligomerization site，OS）以及核定位信號(hào)區(qū)（nuclear localization signal，NLS）。這些結(jié)構(gòu)域決定了轉(zhuǎn)錄因子的功能和特性（Liu et al., 1999）。轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（TFBS）是與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的靶基因上游5'端特殊的一段DNA序列，也稱為DNA結(jié)合基序（motif）。一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子往往同時(shí)調(diào)控若干個(gè)基因，在不同基因上TFBS具有一定的保守性，但又具有一定的差異。

      植物轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)建成、響應(yīng)外界環(huán)境變化等方面起重要的調(diào)節(jié)作用，而且在植物性狀改良和新品種培育方面具有廣闊的應(yīng)用前景（Yang et al., 2004）。因此，近些年來(lái)，轉(zhuǎn)錄因子在植物基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究領(lǐng)域備受大家的關(guān)注，是研究的熱點(diǎn)之一。

植物通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑響應(yīng)非生物和生物脅迫（Hrmova et al., 2021）

     植物受到非生物脅迫（例如：干旱、熱、鹽、冷）和生物脅迫（例如：病毒、細(xì)菌、真菌、昆蟲）后，通過(guò)細(xì)胞膜表面的受體感知脅迫信號(hào)，進(jìn)而激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)（例如：第二信使激活、激酶活化、磷酸化/去磷酸化）的發(fā)生，調(diào)控多種轉(zhuǎn)錄因子及應(yīng)激反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，從而介導(dǎo)脅迫的耐受和抵抗，并恢復(fù)細(xì)胞和組織穩(wěn)態(tài)。

在植物非生物脅迫（干旱和鹽）信號(hào)通路中，轉(zhuǎn)錄因子作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵組成部分的示意圖（Hussain et al., 2021）

植物轉(zhuǎn)錄因子可分為多個(gè)家族（例如：AP2/ERF、bHLH、bZIP、HD-Zip、MYB、NAC、WRKY、MADS等），且數(shù)量繁多，功能多樣，增加了轉(zhuǎn)錄因子的研究難度。

植物轉(zhuǎn)錄因子研究策略及常用的實(shí)驗(yàn)方法

在此，我們總結(jié)了植物轉(zhuǎn)錄因子的研究策略和方法。希望可以為模式植物及非模式植物中，轉(zhuǎn)錄因子對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究增磚添瓦。

    藍(lán)景科信專注為國(guó)內(nèi)高等院校和研究機(jī)構(gòu)提供創(chuàng)新的技術(shù)解決方案和應(yīng)用工具。尤其是對(duì)于分子間相互作用的研究，例如：DNA親和純化測(cè)序（DAP-seq），該技術(shù)可高通量地檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子及DNA結(jié)合蛋白在基因組上的結(jié)合位點(diǎn)，鑒定下游靶基因。我們擁有100+物種，1000+轉(zhuǎn)錄因子的DAP-seq實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)。在DAP-seq技術(shù)服務(wù)領(lǐng)域我們的客戶有中國(guó)科學(xué)院植物所、遺傳發(fā)育所、動(dòng)物所、中國(guó)農(nóng)科院畜牧所、棉花所、果樹所、基因組所、中國(guó)林科院、中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)、浙江大學(xué)等幾十所高等院校或科研機(jī)構(gòu)。而且，使用該技術(shù)已助力客戶在許多期刊成功發(fā)表文章，例如：Molecular Plant，The Plant Cell，Plant Physiology，Plant Biotechnology Journal，Journal of Integrative Plant Biology，New Phytologist等。

下面，我們將結(jié)合具體的文章案例對(duì)植物轉(zhuǎn)錄因子研究套路進(jìn)行剖析和解讀。

文章案例（一）

文章題目：Phytochrome interacting factor regulates stomatal aperture by coordinating red light and abscisic acid

發(fā)表期刊：The Plant Cell

1. 篩選轉(zhuǎn)錄因子OsPIL15

根據(jù)前期研究基礎(chǔ)，找到一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子水稻PIF家族成員OsPIL15。該轉(zhuǎn)錄因子參與水稻氣孔運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。

2. 研究OsPIL15的基因功能

通過(guò)OsPIL15過(guò)表達(dá)和敲除突變體株系的表型觀察、蒸騰作用相關(guān)生理指標(biāo)檢測(cè)分析、突變體回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)、不同光照處理后的生理指標(biāo)檢測(cè)分析，得出結(jié)論OsPIL15通過(guò)促進(jìn)氣孔閉合進(jìn)而負(fù)調(diào)節(jié)蒸騰作用，并且OsPIL15參與了紅光/遠(yuǎn)紅光誘導(dǎo)的水稻氣孔孔徑調(diào)節(jié)。進(jìn)一步采用ABA處理后表型觀察、生理指標(biāo)檢測(cè)分析、內(nèi)源ABA含量測(cè)定，明確了OsPIL15參與ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉過(guò)程。

3. 鑒定轉(zhuǎn)錄因子OsPIL15的下游靶基因

主要實(shí)驗(yàn)：RNA-seq、RT-qPCR、DAP-seq、RNA-seq與DAP-seq聯(lián)合分析、雙熒光素酶報(bào)告（Dual-Luc）實(shí)驗(yàn)、電泳遷移率測(cè)定（EMSA）實(shí)驗(yàn)、OsABI5啟動(dòng)子序列分析、OsABI5的突變體株系實(shí)驗(yàn)

通過(guò)上述一系列實(shí)驗(yàn)，得出實(shí)驗(yàn)結(jié)論：OsABI5是OsPIL15調(diào)控氣孔運(yùn)動(dòng)的直接靶基因。

OsABI5是OsPIL15調(diào)控氣孔孔徑的直接靶點(diǎn)

A. DAP-seq鑒定了水稻OsPIL15結(jié)合的保守結(jié)合基序PBE-box：CACATG；B. 各株系置于不同光照處理下OsABI5的相對(duì)表達(dá)水平；C和D. Dual-Luc實(shí)驗(yàn)說(shuō)明OsPIL15誘導(dǎo)了OsABI5的轉(zhuǎn)錄：C. Dual-Luc載體構(gòu)建示意圖、D. 相對(duì)熒光強(qiáng)度；E和F. EMSA實(shí)驗(yàn)說(shuō)明OsPIL15與OsABI5啟動(dòng)子區(qū)的PBE-box結(jié)合：E. OsABI5啟動(dòng)子示意圖（紅色標(biāo)注PBE-box）、F. EMSA結(jié)果（黑色箭頭為結(jié)合條帶）；G-I. 利用水稻OsABI5突變體株系研究OsABI5基因?qū)φ趄v作用的影響：G. 蒸騰速率、H. 氣孔導(dǎo)度、I. 水分利用效率（iWUE）。

4. 鑒定OsPIL15上游調(diào)節(jié)因子

主要實(shí)驗(yàn)：酵母雙雜交（Y2H）實(shí)驗(yàn)、雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）實(shí)驗(yàn)、Pull down實(shí)驗(yàn)、互作蛋白OsHHO3的突變體株系實(shí)驗(yàn)、雜交雙突變體Ospil15-2 Oshho3-2的株系實(shí)驗(yàn)、Dual-Luc實(shí)驗(yàn)、RT-qPCR實(shí)驗(yàn)

通過(guò)上述一系列實(shí)驗(yàn)，得出實(shí)驗(yàn)結(jié)論：OsHHO3與OsPIL15結(jié)合，協(xié)同調(diào)節(jié)氣孔運(yùn)動(dòng)。

OsHHO3與OsPIL15相互結(jié)合協(xié)同調(diào)節(jié)氣孔運(yùn)動(dòng)

A. Y2H實(shí)驗(yàn)；B. BiFC實(shí)驗(yàn)；C. Pull down實(shí)驗(yàn)；D-H. 利用水稻OsHHO3敲除突變體株系研究OsHHO3基因?qū)φ趄v作用的影響：D. 蒸騰速率、E. 氣孔導(dǎo)度、F. iWUE、G. 三種不同開度氣孔的百分比、H. 氣孔空隙面積（SPA）；I-K. 比較單突變體Ospil15-2、Oshho3-2和雜交雙突變體Ospil15-2 Oshho3-2之間蒸騰作用的差異：I. 蒸騰速率、J. 氣孔導(dǎo)度、K. iWUE；L. 比較OsABI5基因在各突變體株系中的相對(duì)表達(dá)水平；M和N. Dual-Luc實(shí)驗(yàn)：M. Dual-Luc載體構(gòu)建示意圖、N. 相對(duì)熒光強(qiáng)度。

5. 研究玉米中同源基因的功能（拓展轉(zhuǎn)錄因子研究廣度）

通過(guò)EMS誘變獲得玉米突變體株系，隨后開展一系列表型觀察和生理指標(biāo)檢測(cè)分析，最終得出結(jié)論：ZmPIF1和ZmPIF3具有調(diào)節(jié)玉米氣孔開度的功能，因此PIFs介導(dǎo)的氣孔開度調(diào)控機(jī)制在植物中可能是保守的。

6. 構(gòu)建OsPIL15調(diào)控的分子機(jī)制模型

該研究發(fā)現(xiàn)了水稻轉(zhuǎn)錄因子OsPIL15與OsHHO3相互作用，促進(jìn)水稻OsABI5的轉(zhuǎn)錄。OsPIL15通過(guò)與OsABI5啟動(dòng)子的PBE-box基序結(jié)合調(diào)控氣孔開度。此外，與OsPIL15同源的玉米PIF家族基因ZmPIF1和ZmPIF3也負(fù)調(diào)控玉米的氣孔開度，表明PIF調(diào)控的氣孔運(yùn)動(dòng)在植物中可能是保守的。

OsPIL15通過(guò)協(xié)調(diào)紅光和ABA信號(hào)調(diào)節(jié)氣孔運(yùn)動(dòng)的機(jī)制模式圖

在晚上phy轉(zhuǎn)化為不活躍的Pr形式，并定位于細(xì)胞質(zhì)，導(dǎo)致OsPIL15在細(xì)胞核中積累。OsPIL15通過(guò)與OsABI5啟動(dòng)子結(jié)合，增強(qiáng)OsABI5的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)水稻氣孔關(guān)閉，降低蒸騰作用。此外，OsHHO3與OsPIL15相互作用，促進(jìn)OsPIL15與OsABI5啟動(dòng)子的結(jié)合。在白天紅光促進(jìn)phys轉(zhuǎn)化為活躍的Pfr形式，并遷移到細(xì)胞核中，于是OsPIL15蛋白被細(xì)胞核中的Pfr降解，不再誘導(dǎo)OsABI5的表達(dá)，從而促進(jìn)水稻氣孔開放，提高蒸騰作用。

文章小結(jié)：該研究揭示了PIFs在紅光介導(dǎo)的氣孔運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮作用的分子機(jī)制，并證明了PIFs可以通過(guò)協(xié)調(diào)紅光和ABA信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)調(diào)節(jié)氣孔開度。

文章案例（二）

文章題目：Allelic variation in transcription factor PtoWRKY68 contributes to drought tolerance in Populus

發(fā)表期刊：Plant Physiology

1. 篩選轉(zhuǎn)錄因子PtoWRKY68

對(duì)不同自然種群的300份中國(guó)白楊材料進(jìn)行干旱相關(guān)性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS），篩選到顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)及其關(guān)聯(lián)基因PtoWRKY68（WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子）。基因表達(dá)水平分析和轉(zhuǎn)基因擬南芥株系實(shí)驗(yàn)表明PtoWRKY68是一個(gè)植物耐旱性的正調(diào)控因子。

2. 研究PtoWRKY68等位基因的功能

基于PtoWRKY68基因的序列變異分析，將毛白楊分為兩個(gè)單倍型類群：PtoWRKY68^hap1和PtoWRKY68^hap2。通過(guò)等位基因頻率調(diào)查分析、基因表達(dá)水平檢測(cè)、干旱相關(guān)性狀分析、轉(zhuǎn)基因擬南芥株系實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)PtoWRKY68^hap1（耐旱等位基因）的耐旱性強(qiáng)于PtoWRKY68^hap2（干旱敏感等位基因），而且二者對(duì)干旱脅迫響應(yīng)的差異并不是由于PtoWRKY68等位基因表達(dá)水平的差異所致，可能與等位基因變異對(duì)干旱脅迫的不同響應(yīng)機(jī)制有關(guān)。

3. 鑒定轉(zhuǎn)錄因子PtoWRKY68的下游靶基因

主要實(shí)驗(yàn)：RNA-seq、共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析、DAP-seq、RNA-seq與DAP-seq聯(lián)合分析、Dual-Luc實(shí)驗(yàn)、EMSA實(shí)驗(yàn)、楊樹種群及轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中的靶基因表達(dá)水平分析、ABA敏感實(shí)驗(yàn)、干旱脅迫相關(guān)生理指標(biāo)檢測(cè)

基于上述一系列實(shí)驗(yàn)分析，鑒定了PtoWRKY68^hap1和PtoWRKY68^hap2的結(jié)合基序（分別是W1-box、W2-box）及其靶基因（PtoDTX49.1、PtoABF2.1和PtoRD26.1）。PtoWRKY68介導(dǎo)了靶基因在干旱脅迫下的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，且相比于PtoWRKY68^hap2，PtoWRKY68^hap1對(duì)靶基因啟動(dòng)子具有更高的親和力。干旱脅迫下PtoWRKY68^hap1通過(guò)增強(qiáng)干旱脅迫信號(hào)通路和ABA信號(hào)通路以及減少ABA外排，從而增加細(xì)胞中ABA積累，最終增強(qiáng)植物的耐旱性。

DAP-seq鑒定PtoWRKY68等位基因的靶基因

A. 水分充足及干旱脅迫下的基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)模塊，在重疊基因中包含了PtoWRKY68；B和C. DAP-seq分析PtoWRKY68^hap1(B)和PtoWRKY68^hap2(C)的peaks在基因組上的分布；D和E. PtoWRKY68^hap1(D)和PtoWRKY68^hap2(E)的結(jié)合基序分別是W1-box和W2-box；F和G. PtoWRKY68^hap1(F)和PtoWRKY68^hap2(G)的靶基因富集的KEGG通路；H. Venn圖顯示有3個(gè)重疊基因；I-K. 箱型圖展示3個(gè)靶基因PtoRD26.1、PtoDTX49.1、PtoABF2.1的相對(duì)表達(dá)水平(FPKM值)。

4. 鑒定PtoWRKY68上游調(diào)節(jié)因子

主要實(shí)驗(yàn)：數(shù)量性狀位點(diǎn)（eQTL）分析、EMSA實(shí)驗(yàn)、Dual-Luc實(shí)驗(yàn)

eQTL分析發(fā)現(xiàn)PtoSVP.3受干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，其表達(dá)水平與PtoWRKY68呈正相關(guān)。EMSA和Dual-Luc實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了PtoSVP.3通過(guò)與PtoWRKY68啟動(dòng)子區(qū)域的CArG基序結(jié)合，促進(jìn)PtoWRKY68的表達(dá)。

5. 構(gòu)建PtoWRKY68調(diào)控的分子機(jī)制模型

提出了PtoWRKY68調(diào)控楊樹耐旱性的分子機(jī)制模型PtoSVP.3-PtoWRKY68-PtoDTX49.1/PtoABF2.1/PtoRD26.1。為應(yīng)對(duì)干旱脅迫，PtoSVP.3正向調(diào)控PtoWRKY68，PtoWRKY68等位基因通過(guò)誘導(dǎo)PtoRD26.1和PtoABF2.1的表達(dá)以及抑制PtoDTX49.1的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控ABA信號(hào)傳導(dǎo)和積累來(lái)增強(qiáng)楊樹的耐旱性。

PtoWRKY68調(diào)控楊樹耐旱性的分子機(jī)制模型

在干旱脅迫下，PtoWRKY68等位基因受PtoSVP.3的正向調(diào)控，PtoWRKY68^hap1（上圖）等位基因變異增強(qiáng)了對(duì)PtoRD26.1和PtoABF2.1的結(jié)合和激活，抑制PtoDTX49.1，從而調(diào)節(jié)ABA外排和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)獲得耐旱性。相比于PtoWRKY68^hap1，PtoWRKY68^hap2（下圖）對(duì)下游靶點(diǎn)具有較低的結(jié)合親和力和激活能力。因此，具有PtoWRKY68^hap1等位基因的楊樹材料其抗旱性優(yōu)于具有PtoWRKY68^hap2等位基因的楊樹材料。

文章小結(jié)：該研究提出了PtoWRKY68調(diào)控楊樹耐旱性的分子機(jī)制。該調(diào)控模塊的鑒定為深入了解楊樹耐旱性的遺傳基礎(chǔ)提供了新見解，并為利用分子育種技術(shù)開發(fā)耐旱樹木新品種提供了潛在的靶點(diǎn)。

文章案例（三）

文章題目：Overexpression of the transcription factor MdWRKY115 improves drought and osmotic stress tolerance by directly binding to the MdRD22 promoter in apple

發(fā)表期刊：Horticultural Plant Journal

1. 篩選轉(zhuǎn)錄因子MdWRKY115

基于蘋果基因組數(shù)據(jù)，分析了WRKY基因家族成員，并克隆了蘋果基因MdWRKY115。序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析表明MdWRKY115是第Ⅲ組WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子。

2. 驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子MdWRKY115

qRT-PCR結(jié)果表明干旱和滲透脅迫下MdWRKY115表達(dá)上調(diào)。GUS活性分析表明在滲透脅迫下MdWRKY115的啟動(dòng)子活性明顯增強(qiáng)。亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)MdWRKY115定位于細(xì)胞核。轉(zhuǎn)錄激活分析結(jié)果證明了MdWRKY115是一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子。

3. 研究MdWRKY115的基因功能

轉(zhuǎn)基因株系的表型分析表明，在擬南芥幼苗和蘋果愈傷組織中過(guò)表達(dá)MdWRKY115，顯著提高了它們對(duì)干旱和滲透脅迫的耐受性。

4. 鑒定轉(zhuǎn)錄因子MdWRKY115的下游靶基因

主要實(shí)驗(yàn)：DAP-seq、EMSA實(shí)驗(yàn)、轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織中靶基因表達(dá)水平檢測(cè)

DAP-seq鑒定了MdWRKY115的結(jié)合元件是W-box基序（核心序列TTGAC）以及與脅迫相關(guān)的靶基因MdRD22。EMSA驗(yàn)證了MdWRKY115與MdRD22啟動(dòng)子的特異性結(jié)合。對(duì)轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)MdWRKY115能夠促進(jìn)MdRD22的表達(dá)。因此，MdWRKY115通過(guò)直接與MdRD22的啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)控其表達(dá)。

MdWRKY115直接結(jié)合MdRD22啟動(dòng)子，調(diào)控其表達(dá)

A. DAP-seq鑒定了MdWRKY115的DNA結(jié)合基序W-box；B.EMSA驗(yàn)證了MdWRKY115與靶基因MdRD22啟動(dòng)子的結(jié)合；C.轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織中MdRD22的表達(dá)差異說(shuō)明MdWRKY115的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了MdRD22的表達(dá)上調(diào)。

5. 構(gòu)建MdWRKY115調(diào)控的分子機(jī)制模型

該研究鑒定了蘋果中與干旱和滲透脅迫耐受性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子MdWRKY115。MdWRKY115通過(guò)與MdRD22啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)控MdRD22的表達(dá)，提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥和蘋果愈傷組織對(duì)干旱和滲透脅迫的耐受性。

文章小結(jié)：該研究提出了MdWRKY115通過(guò)調(diào)控MdRD22的表達(dá)增強(qiáng)蘋果對(duì)干旱和滲透脅迫耐受性的分子機(jī)制，這對(duì)利用分子遺傳策略培育耐旱植物新品種具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

Liu L, White MJ, MacRae TH. Transcription factors and their genes in higher plants functional domains, evolution and regulation. Eur J Biochem. 1999 Jun;262(2):247-57. doi: 10.1046/j.1432-1327.1999.00349.x.

Yang ZR, Wang XC, Li XM, Yang CD. [Transcription factors in higher plant]. Yi Chuan. 2004 May;26(3):403-8. Chinese.

Hrmova M, Hussain SS. Plant Transcription Factors Involved in Drought and Associated Stresses. Int J Mol Sci. 2021 May 26;22(11):5662. doi: 10.3390/ijms22115662.

Hussain Q, Asim M, Zhang R, Khan R, Farooq S, Wu J. Transcription Factors Interact with ABA through Gene Expression and Signaling Pathways to Mitigate Drought and Salinity Stress. Biomolecules. 2021 Aug 5;11(8):1159. doi: 10.3390/biom11081159.

以下參考文獻(xiàn)中的DAP-seq技術(shù)支持由藍(lán)景科信提供。

Li Q, Zhou L, Chen Y, Xiao N, Zhang D, Zhang M, Wang W, Zhang C, Zhang A, Li H, Chen J, Gao Y. Phytochrome interacting factor regulates stomatal aperture by coordinating red light and abscisic acid. Plant Cell. 2022. 34: 4293-4312. doi: 10.1093/plcell/koac244.

Fang Y, Wang D, Xiao L, Quan M, Qi W, Song F, Zhou J, Liu X, Qin S, Du Q, Liu Q, El-Kassaby YA, Zhang D. Allelic variation in transcription factor PtoWRKY68 contributes to drought tolerance in Populus. Plant Physiol. 2023 May 29:kiad315. doi: 10.1093/plphys/kiad315.

Dong Q, Tian Y, Zhang X, Duan D, Zhang H, Yang K, Jia P, Luan H, Guo S, Qi G, Mao K, Ma F, Overexpression of the transcription factor MdWRKY115 improves drought and osmotic stress tolerance by directly binding to the MdRD22 promoter in apple, Horticultural Plant Journal. doi: 10.1016/j.hpj.2023.05.005.